KLONING FRAGMEN DNA PENGKODE S80-180 GALUR ALAMI DAN MUTAN G145R VIRUS HEPATITIS B PADA ESCHERICHIA COLI JM109

TINA ROSWATI ROSTINAWATI; debbie sofie retnoningrum

doi:10.24198/jf.v14i1.8558

KLONING FRAGMEN DNA PENGKODE S80-180 GALUR ALAMI DAN MUTAN G145R VIRUS HEPATITIS B PADA ESCHERICHIA COLI JM109

TINA ROSWATI ROSTINAWATI, debbie sofie retnoningrum

Abstrak

Virus hepatitis B (HBV) merupakan penyebab infeksi hepatitis kronis di dunia. Pemberian vaksin yang mengandung protein S dapat menginduksi antibodi protektif melawan semua subtipe HBV. Sebuah mutasi titik pada gen pengkode determinan “a” HBsAg yang menyebabkan substitusi glisin (G) oleh arginin (R) pada posisi 145 (mutan G145R) menurunkan kemampuan pengikatan antibodi yang diinduksi oleh antigen HBsAg galur alami dan ini merupakan salah satu contoh mutan lolos vaksin. Protein rekombinan dapat melengkapi uji imunologi yang saat ini hanya spesifik untuk HBsAg galur alami. Penelitian ini difokuskan pada gen pengkode fragmen S80-180 (merentang residue pada posisi 80 hingga 180 protein S). Tujuan penelitian adalah mengkonstruksi gen pengkode protein S80-180 galur alami dan mutan G145R pada vektor kloning pGEM-T pada Escherichia coli ( E. coli ) JM109. Fragmen DNA pengkode protein S80-180 galur alami dan mutan G145R diamplifikasi dengan reaksi polimerase berantai (PCR) menggunakan cetakan HBV. Produk PCR tersebut diligasikan pada vektor kloning pGEM-T dan hasil ligasi ditransformasikan ke E. coli JM109. Transforman diskrining dengan ampisilin dan sistem seleksi biru / putih. Plasmid dari transforman putih resisten ampisilin diisolasi dan dikarakterisasi dengan analisis migrasi, PCR, pemotongan ganda, dan penentuan urutan nukleotida DNA sisipan. Hasil analisis migrasi menunjukkan bahwa pGEM-T rekombinan bermigrasi lebih lambat dibandingkan dengan pGEM-T non rekombinan. PCR menggunakan primer T7 dan SP6 menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 500 pasangan basa (pb) yang hampir sama dengan ukuran teoritis , 545 pb. . Analisis pemotongan dengan enzim BamHI dan NdeI memberikan pita DNA sisipan yang berukuran di bawah 500 pb (secara teoritis 339 pb) dan pGEM-T linier yang berukuran sekitar 3000 pb. Analisis terhadap hasil penentuan urutan nukleotida menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Tool) menunjukkan bahwa DNA sisipan untuk gen pengkode S80-180 galur alami dan mutan G145R memiliki homologi 99% dengan urutan nukleotida gen S (kode akses GenBank AB113220.1 dan AB 113238.1). Hasil pensejajaran urutan nukleotida gen pengkode S80-180 galur alami dengan mutan G145R

Kata Kunci

Virus hepatitis B, HBsAg, mutan lolos vaksin, G145R

Teks Lengkap:

PDF

Referensi

Aprillia, H., 2004, Penentuan Keberadaan Vaccine Escape Mutant dan Subtipe Virus Hepatitis B dari Beberapa Kota di Pulau Jawa, Skripsi Departemen Farmasi FMIPA ITB, Bandung, 4-6.

Carman, W. F., A. R. Zanetti, P. Karayiannis, J. Waters, G. Manzillo, 1990, Vaccine-

Induced Escape Mutant of Hepatitis B Virus, Lancet, 336, 325-329.

Chen, H. B., D. X. Fang, F. Q. li, H. Y. Jing, W. G. Tan and S. Q. Li, 2003, A Novel Hepatitis B Virus Mutant with A-to-G at nt551 in the Surface Antigen Gene, World J. Gastroenterol., 9 (2), 304-308.

Chen, W. N. and C. J. Oon, 1999, Human Hepatitis B Virus Mutants : Significance of Molecular Changes, FEBS Lett., 453 (3), 237-242.

Chen, W. N. and C. J. Oon, 2000, Hepatitis B Virus Surface Antigen (HBsAg) Mutants I Singapore Adult and Vaccinated Children with High Anti-Hepatitis B Virus Antibody Levels but Negative for HBsSAg, J. Clin. Microbiol., 38(7), 2793-2794.

Chiou, H. L., T. S. Lee, J. Kuo, Y. C. Mau, and M. S. Ho, 1997, Altered Antigenicity of ‘a’ Determinant Variants of Hepatitis B, J. Virol., 78, 2639-2645.

Coleman, P. F, 2006, Detecting Hepatitis B Surface Antigen Mutants, Emerging Infection Diseases, 12(2), 5-38.

Flint S. J., L. W. Enquist, R. M. Krug, and A. M. Skalka, 2000, Virology : Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, ASM Press, Washington, 766.

Garcia, F., M. C. Bernal, A. Leyva, G. Piedrola and M. C. Maroto, 1995, Evaluation of Enzyme Immunoassay for Hepatitis B Virus DNA Based on Anti-Double-Stranded DNA, J. Clin. Microbiol, 33 (2), 413-415.

Glebe, D., M. Aliakbari, P. Krass, E. V. Knoop, K. P. Valerius, and W. H. Gerlich, 2003, Pre-S1 Antigen-Dependent Infection of Tupaia Hepatocyte Cultures with Human Hepatitis B Virus, J. Virol., 77(17), 9511-9521.

Ho, M. S., C. F. Lu, J. Kuo, Y. C. Mau, and W. W. Chao, 1995, A Family Cluster of an Immune Escape Variant of Hepatitis B Virus Infecting a Mother and Her Two Fully Immunized Children, Clin. Diagnostic. Lab. Immunol., 2(6), 760-762.

Kumar A, and N. Joshi, 2001, Immunoprophylaxis of Hepatitis B Virus Infection, IJMM., 19 (4), 1-10.

Lee, W. M., 1997, Hepatitis B Virus Infection, N. Engl. J. Med., 337 (24), 1733-1745.

Paulij, W. P., P. L. M de Wit, C. M. G. Sunnen, M. H. van Roosmalen, A. van Ettekoven, M. P. Cooreman, and R. A. Heijtink, 1999, Localization of a Unique Hepatitis B Virus Epitope Sheds New Light on the Structure of Hepatitis B Virus Surface Antigen, J. Virol., 80, 2121-2126.

Prince, A. and D. Ganem, 2004, Hepatitis B Virus Infection-Natural History and Clinical Consequences, N. Engl. J. Med., 450 (11), 1118-1129.

Qin, S., H. Tang, L. Zhao, F. He, Y. Lin, L. Liu, and X. He, 2003, Cloning of HBsAg-encoded Genes in Different Vectors and Their Expression in Eukaryotic Cell, World J. Gastroenterol., 9(5), 1111-1113.

Seeger, C. and W. S. Mason, 2000, Hepatitis B Virus Biology, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64(1), 51-68.

Singh, M., R. Cattaneo, and M. A. Billeter, 1999, A Recombinant Measles Virus Expressing Hepatitis B Virus Surface Antigen Induces Humoral Immune Responses in Genetically Modified Mice, J. Virol., 73(6), 9511-9521.

Soussan, P., S. Pol, F. Garreau, C. Brechot, and D. Kremsdorf, 2000, Vaccination of Chronic Hepatitis B Virus Carries with PreS2/S Envelope Protein Is Not Associated with the Emergence of Envelope Escape Mutants, J. Virol., 82, 367-371